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食用微生物色素的研究进展
加入时间:2016年6月12日18:15
                                 食用微生物色素的研究进展
                                   徐春明,王晓丹,焦志亮
    (北京工商大学食品学院食品添加剂与配料北京高校工程研究中心,北京市食品风味化学重点实验室,北京 100048)
    摘 要:随着人们对食品添加剂的广泛热议,食用色素也备受关注。由于现代生活水平的提高,人们开始追求更加健康的生活方式,故合成食用色素已经不能满足人们的要求。因此,天然来源的食用色素已经成为当今食用色素发展的主流。食用天然色素是指由天然资源中获得的食用色素,主要是指从动物和植物组织及微生物发酵液中提取的色素。但是植物来源的色素会存在来源不易保证、经济花费高和技术方面的问题,而微生物产食用色素则刚好可以解决这些问题。微生物产色素具有生产周期短、产量高的特点,利用微生物产色素则成为当今天然色素的发展趋势。本文将综述微生物色素的分类研究、有食用价值的聚酮类色素及其生产菌株的研究进展,并对其可能产生的毒素进行探讨。
    关键字:微生物;食用色素;毒素;生产研究   中图分类号:TS202.3 文献标识码:A 文章编号:1006 - 2513(2015)02 - 0162 - 07
    近年来,人们生活水平的提高增加了市场对天然色素的需求。食用天然色素是指由天然资源获得的食用色素,主要是指从动物和植物组织及微生物发酵液中提取的色素。但是植物色素的来源大都是来自热带植物,原料来源不易保证。植物组织培养技术产色素的研究,从根本上解决了原料的供给,生产出质量稳定的产品[1-3]。但是目前此种方法经济花费较高,仍然不利于商业生产。另一方面利用植物细胞培养生产色素还有一些技术问题尚待解决。
    利用微生物发酵生产色素可能会克服以上困难。微生物色素有很多种类和颜色。这些色素有的是在胞内的,有的是在胞外的;有自身合成的,有转化培养基中的某些成分而形成的。微生物色素是一种次生代谢产物,一般是在菌体生长后期合成的。由微生物发酵产生的色素在自然中非常常见。在众多的物质中,常见的有:类胡萝卜素、黑色素、黄素类、醌类和一些更加特别的色素,红曲色素、紫色杆菌素、藻青蛋白或靛蓝等[4]。用于产食用色素的微生物色素需具有以下几方面特征:(1)产色素菌对人体是非致病菌;(2)生产条件安全且菌株不产毒素;(3)菌体可以用于液体发酵。然而在发酵过程中许多微生物产色素往往伴有毒素的产生,而且许多有食用价值的微生物色素至今开发研究的甚少。因此本文综述了食用微生物色素的生产菌株的培育、色素的提取分离和毒素的研究,以期为推动天然食用色素的发展做出贡献。
    1· 几种常见微生物色素研究进展
    1.1 类胡萝卜素的生产研究
    自从19 世纪初分离出胡萝卜素,至今已经发现近450 种天然的类胡萝卜素。常见的有:α-胡萝卜素、β- 胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、番茄红素和虾青素。类胡萝卜素均来源于类异戊二烯和萜类化合物途径。细菌、酵母、霉菌等微生物均可产生大量的类胡萝卜素,因而利用微生物产天然色素是一项非常有前景和商业价值的研究,对此类天然色素的研究也层出不穷。例如,早在1996 年,Wissgott 等[5]利用三孢布拉霉生产β- 胡萝卜素和番茄红素现在已经作为食品级色素在使用。
    类胡萝卜素是高度不饱和化合物,不溶于水而溶于有机溶剂,含有一系列共轭双键和甲基支链。色素的颜色随着共轭双键的数目而变动。共轭双键的数目越多,颜色移向红色越远[6]。目前,生产类胡萝卜素的主要有丝状真菌、酵母、细菌和藻类,如冠霉素链霉菌、三孢布拉霉、布拉克须霉、黄杆菌属、法夫酵母属、红酵母属。Ayerim 等[7]对固体培养黏红酵母YB-252 生产类胡萝卜素进行了研究,采用Plackett-Burman 试验设计方法,结果表明,调节剂浓度、发酵时间和系统中发酵湿度是影响黏红酵母YB-252 生产类胡萝卜素产量的主要因素。Sun 等[8]对红发夫酵母进行了低剂量射线辐照实验。研究表明红发夫酵母是唯一能够产生虾青素的酵母,具有较强的发酵糖的能力。经过重复的射线辐照和目视法筛选获得一株菌株3A4-8。经过辐照后的每克酵母可产生3.3mg 类胡萝卜素,比未经辐照菌株的产量增加了50%。经过辐照后只有此菌株能够生存,因此射线辐照方法可用于产类胡萝卜素菌株的筛选。在类胡萝卜素的提取、浓缩、结晶和微胶囊化工艺的建立中,有人对法夫酵母JMUMVP14进行了研究。发现用乳酸或二甲基亚砜破壁后再用溶剂提取的总类胡萝卜素的提取率可以达到78.53%。选择水、乙醚和乙醇复合体系更加利于类胡萝卜素浓缩物的结晶。微胶囊化时则使用了明胶和淀粉作为壁材使得微胶囊效率达到61.76%,为法夫酵母类胡萝卜素的开发利用奠定了基础[9]。
    1.2 黑色素的生产研究
    黑色素是一种高分子量的生物色素,颜色由深棕色到黑色,由酪胺酸经过一系列化学反应形成,广泛存在于动物、植物和微生物中。它通常是由酚类化合物的氧化聚合形成。微生物产生的黑色素主要分为壁(膜)结合黑色素和胞外色素,不溶于酸性溶液、不溶于常见的有机溶剂,可溶于碱性溶液、微溶于水[10]。常被用于农业、化妆品和药品中。
    产黑色素的微生物也有很多,常见的有:细菌(链球菌、蜡状芽孢杆菌、嗜麦芽假单胞菌)、固氮菌、霉菌(黑曲霉、链格孢菌、构巢曲霉、米曲霉等)、放线菌(链霉菌)以及真菌(出芽短梗霉)[11]。Sivaperuma 等[12]对链霉球属MVCS13 产黑色素进行了研究。在优化实验中得出,产黑色素最佳条件为温度50 ℃、pH7.4,培养基为:甘油10g、L- 酪氨酸0.75g/L、L- 天门冬酰胺1.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、氯化钠0.75g/L、硫酸亚铁0.015g/L。Dong 等[13]首次报道从冬虫夏草中分离得到黑色素。其抗氧化性质也非常强,主要表现为对自由基1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼(DPPH)的清除和对亚铁离子的螯合能力。这对于此类稀少真菌生产黑色素具有很大的指导意义。魏力等[14]从近海沼泽地大米草根际中分离了一株海洋细菌MWYL1。进行初步鉴定后,通过基因组fosmid 文库的构建,直接分离到一个产黑色素的克隆,进一步亚克隆和测序后获得与黑色素产生相关的功能新基因。这对深入研究黑色素的生物合成途径具有一定的理论意义,将有利于人们从基因角度了解黑色素的合成过程,从而为黑色素的大规模安全生产奠定基础。
    1.3 醌类色素的生产研究
    蒽醌类色素是醌类色素中最大的群体,大约有700 种化合物,一直以来被广泛应用于食品和药品当中。在药品方面可作抗癌、抗菌、利尿药物使用。因此,蒽醌类色素在食品色素方面的应用前景广阔。蒽醌类化合物广泛存在于微生物界中,尤其是丝状真菌中,例如,曲霉属真菌、散囊菌属、镰刀菌属、青霉属、裸胞壳属、弯孢叶斑病菌、球腔菌属、小孢霉属等[15]。已经作为食品级色素使用的蒽醌类色素是由草酸青霉产生的Arpink Red—由捷克的一家公司最早发现并命名,该菌在最适发酵条件下可以获得1.5 ~ 2.0g/L 的红色色素[16-18]。
    在羟基萘醌色素的研究中发现曲霉属真菌[19](灰绿曲霉、冠突曲霉、匍匐曲霉)和散囊类菌属[20](阿姆斯特丹散囊菌、谢瓦散囊菌、蜡叶散囊菌)均可发酵产生黄色素大黄素和红色素毛罂红。然而,在这些色素中也都检测到不同的毒素存在,甚至有些毒素也已经被着色,如黄天精、红天精和金色灰绿曲霉素等。而之前的研究中也发现有微生物不产毒素,如红丝膜菌能够产生红色羟基蒽醌类色素,与大黄素、大黄素甲醚共同使果实和孢子呈现红色[21]。在色素生产方面,有人从竹黄真菌中分离得到了蒽醌类色素。发酵液通过有机溶剂萃取、乙酸镁沉淀、硅胶和反相C18 柱色谱层析等方法分离纯化,经HPLC 检测分析,此体系分离到的色素纯度高达97%。稳定性实验显示,该类蒽醌色素对光、温度、一定浓度蔗糖和柠檬酸具有良好的稳定性,而且具有清除自由基的作用,对霉菌有明显的抑菌效果[22]。
    1.4 聚酮类色素的生产研究
    聚酮类色素作为一种具有潜力的食用色素还未得到充分的开发研究,因此,加大对聚酮类色素的开发具有很好的未来前景。丝状真菌是食用聚酮类色素的一个良好来源。真菌菌株的发酵产物中产生较多的次级代谢产物,其中有多变的化学结构和不同的生物活性。这些发酵产物中含有丰富的天然色素,其中聚酮类色素是数量最多、结构最多样的色素之一。
    红曲霉色素作为食用天然色素被使用已经有悠久的历史,尤其是在中国和日本。红曲霉色素是一系列结构和化学性质相似的嗜氮酮混合物,主要成分包括红曲黄素、红曲素、红斑素、红曲红素、红斑胺和红曲红胺,分子结构见图1。颜色包括黄色、橘黄色和红色。其发酵产生许多代谢产物,功效成分也具有悠久的研究历史。红曲霉色素具有抗诱变和抗癌、抗菌、抗炎症、潜在的抗肥胖、抗糖尿病等功能[23]。首次从红曲霉中分离出降低胆固醇的活性成分是1979年的日本Endo[24]教授,并将其命名为莫那可林K(MonacolinK)。随后又有众多学者做了大量动物实验,结果显示,此活性物质对人体安全无副作用,并具有良好的降胆固醇、降血脂的双重作用。
    Feng[23]等人对红曲霉色素的生物合成途径做了综述,认为红曲霉色素的合成途径仍然存在争议。其次还对红曲霉色素的提取、分离、纯化和鉴定做了详细研究。由于该色素是水溶性色素,故可用乙醇等有机溶剂萃取。分离纯化可以用柱层析、薄层色谱、高效液相层析、毛细管电泳和高速逆流色谱。鉴定方法有核磁共振或核磁共振联用UV-vis、IR、MS、GC-MS、LC-MS、HRMS 等。Mukherjee 等人[25]用己烷提取紫红曲霉中的红曲色素,采用薄层色谱法、柱层析和半制备高效液相色谱提纯,得到的纯化色素使用UV-vis、IR、GC-MS、NMR 方法分析。结果显示纯化后的色素与传统的色素红斑胺和红曲红胺很相似,但是纯化后的色素对革兰氏阳性菌有较强的抑菌性。这表明纯化后的色素在食品工业中有更大的应用前景。但是红曲霉发酵能够产生的真菌毒素—桔霉素。桔霉素具有肝脏毒性和肾毒性,因此红曲色素在西方一些国家仍未得到允许。为了控制红曲产品中桔霉素的产生,国内外学者已经从诱变、筛选、改造菌株,改良生产工艺、优化发酵条件及物理、化学法去除桔霉素方面进行了大量工作[26]。
 
    Kang 等[27]通过对氮源的调控提供了一种不产桔霉素的红曲霉培养生产红曲红方法。通过研究表明红曲霉发酵液中的次级代谢物受到环境的影响极大。实验中分别使用谷氨酸钠、玉米粉、硫酸铵和硝酸钠作为培养红曲霉的氮源。通过测定红曲霉色素的成分和发酵液最终pH 发现,氮源可以直接影响发酵液最终的pH,而最终的pH可以决定红曲霉色素的成分和桔霉素的合成途径。结果表明,在硫酸铵或谷氨酸钠作为氮源时发酵液的最终pH 最低,此pH 下产生不含有桔霉素的橘黄色色素。
    2 ·生产食用色素真菌高通量筛选研究
    使用化学分类原理可鉴别产生天然食用色素的真菌,初步了解真菌细胞的前景和潜在安全性。Mapari 等人[28]在研究中对大量真菌可能产生的天然食用色素的安全性做了鉴定。根据生化分类学发现青霉属(Penicillium)和球菌属(Epicoccum)可作为潜在生产食用色素的丝状真菌菌株使用,但是并非所有的青霉属都适合生产天然食用色素。实验对青霉属的亚属做了研究,其中发现岛青霉(P.islandicum)、皱褶青霉菌(P.rugulosum)、变换青霉(P.variabile)、马尔尼菲青霉(P.marneffei)不适合生产天然食用色素,因为它们会产生毒素代谢物或对人类有致病性的物质。而对郝克青霉菌(P.herquei)、产紫青霉(P.purpurogenum)、棘孢青霉(P.aculeatum)、绳状青霉菌(P.funiculosum)、嗜松青霉(P.pinophilum)进行液体培养时,在其次级代谢产物中均未检测到已知毒素,而且这些菌株还可以分泌胞外色素,如红曲黄素、红曲色素、梦那玉红、红曲红胺、PP-R、N- 戊二酰- 红曲红胺、N- 戊二酰- 红斑胺。因此,这些菌株细胞具有可以大批量生产天然食用色素的潜能。同时还可以利用固液联合培养技术,研究类红曲霉嗜氮酮色素及其氨基酸衍生物的生产[29]。在微生物色素研究中,菌体的分离和鉴定研究也是必不可缺的一部分。例如Qiu 等人[30]对产紫青霉的分离和鉴定进行了详细的研究。产紫青霉IAM 15392 在培养基(硝酸铵、可溶性淀粉、酵母膏和pH 为5 的柠檬酸盐缓冲液)中可以生产红曲霉色素同系物(10Z)-12- 羧基- 红曲红胺(简称PP-V)和(10Z)-7-(2- 羟乙基)- 红曲红胺( 简称PP-R)[31]。Arai 等人[32] 也对产紫青霉IAM15392 的色素产量做了研究。紫色色素PP-V 的典型特征是氮取代了分子中的吡喃氧,分子结构见图1。在有利于PP-V 产量的培养条件下,控制合成谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶的基因也得以表达,谷氨酰胺和谷氨酸都利于PP-V 的合成,而谷氨酰胺的有利程度更大。所以,谷氨酰胺合成酶将培养基中的铵合成为谷氨酰胺对PP-V 的生产非常重要。另有报道[33]显示,产紫青霉的某些相关菌种,也能产生类红曲霉聚酮类嗜氮酮色素,而其单个菌株是否含有对人体不利的毒素和其产色素的能力还需要进一步的研究。
    在生产色素的真菌安全性研究中,为了证明可能的色素的生产者存在多样性和潜在性,增加了对枝孢属、虫草属、弯孢属、内脐蠕孢属和拟青霉属的研究。除了红曲霉之外,镰刀菌属、链格孢属和附球菌属也都可以作为产色素的真菌使用。研究发现,镰刀菌属不推荐为生产安全色素的菌株使用;其次,还需要大量的毒理实验来研究链格孢属、枝孢属、虫草属、弯孢属、内脐蠕孢属和拟青霉属发酵物质中是否含有对人体不利的毒素物质,以此来确定是否可以作为潜在安全的生产色素的菌株使用;研究中发现黑附球菌可以推荐为生产安全色素的潜在菌株使用[28]。Stricker 等[34]研究表明黑附球菌产生的水溶性黄色素类似于姜黄色素具有抗氧化的活性。在黑附球菌的耐光性实验中发现其发酵产生的黄色素耐光性均强于姜黄色素和红曲霉色素的耐光性[35]。Mapari 等[36]对黑附球菌的生长、形态学和色素生产方面做了实验研究。因此,黑附球菌可作为食用色素的大规模生产菌株[36],产生的色素在食品工业生产中有更广阔的应用前景。
    海洋生态真菌近年来被广泛的报道,是一类新型的具有很大研究价值的微生物。海洋生物生活在高盐、高压、低温、无光照的环境中,这赋予了海洋生物独一无二的特性。在孢子和菌丝体中细胞壁被着色的细胞比没有被着色的细胞更能忍受脱水- 水合循环和强辐射[37]。因此, 开发海洋真菌色素也具有非常重要的意义。海洋真菌同样可以产生黄色至红色不等的颜色,这些色素大部分属于聚酮类色素。有研究表明,聚酮类化合物可能占据了海洋生态中绝大部分的天然产品[38]。已经发现一株海洋青霉属真菌-Penicilliumbilaii 产生的黄色油类柠檬菌素和2,3-dihydrocitro-mycetin 属于聚酮类色素[39]。韩国学者[40]发现来自海洋的小孢子属真菌可以产生黄色聚酮类灰绿曲霉色素,但也同时含有真菌毒素桔霉素。在中国福建,发现了桐花树内树皮中有青霉属JP-1,并产生一种红色素—penicillenone[41]。由于海洋真菌的特殊性使得海洋真菌色素很难得到大规模生产,但是海洋真菌色素的巨大商业潜力仍吸引着人们去开发和研究。
    3· 微生物色素存在的问题和展望
    天然食用色素的生产途径较少且大部分的原材料来源依赖季节和气候,这限制了色素的多样性。因此,在天然色素的商业化进程中主要考虑三个方面:如何确保色素来源的稳定性、如何确保色素的质和量、如何提高已知色素的功能。在学术研究和工业生产中,人们开始将目光转移到真菌来源的色素上。丝状真菌来源的类胡萝卜素已经被批准应用到食品工业中,这更增加了真菌来源的色素可以广泛应用的可能性。但是关于微生物来源的色素研究大部分还停留在实验室阶段,还是一个相对未被开发的领域。若可以使用化学分类原理选出具有色素生产潜能的菌株,并确保色素的生产效率和产量,就可以避免使用基因操纵的手段来生产色素,使色素的生产过程更加安全。
    作为一种新开发的微生物色素,不仅纯度要求较高,其毒理实验要求也较高,产品不易得到认可。因此,在目前的研究中需要更好的理解微生物如何、为什么以及在何种情况下会产生色素,同时还需要做大量的毒理实验来证明色素的安全性。
    4· 结论
    研究发现,大自然中存在大量能够生产天然色素的菌株,但已经得到开发的菌株数量相对较少。因此,构建真菌细胞工厂以实现微生物色素的工业化大规模生产是今后研究食用色素的重点。就现在食品工业的发展方向而言,微生物色素虽然存在一定的问题,如某些真菌毒素难以分离、微生物发酵液物质种类复杂难以提纯及不易选择合适的生产菌株等,但是随着现代生物技术的发展,微生物色素仍然可能成为今后天然食用色素的发展重点。
    参考文献:略
文章来自:中国食品添加剂应用网
文章作者:webmaster
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